作者：微生态
编译：微科盟张嘻嘻，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。
导读
目前，情绪障碍是全球范围普遍存在的一个健康问题，一个人的情绪障碍会影响他的个人健康及社会互动能力，进而导致慢性疾病等状况。情绪障碍的症状包括持续性感到悲伤、无助、绝望和易怒，而改善情绪的药物主要依靠调控脑内单胺能神经递质系统，但由于这些药物普遍存在延迟起效和反应率低等特点，因此其疗效尚存争议。因此，寻求防治情绪障碍的新疗法显得尤为迫切。目前，研究者们尝试从营养学、微生物学等领域开展相关研究，特别是关注饮食与情绪的关系。有研究已表明，饮食干预可有效缓解焦虑和抑郁状态，从而显著提高患者生活质量，而摄入可可类产品（如黑巧克力）是众多饮食有效干预措施之一。有动物研究表明，可可多酚提取物具有抗氧化和抗炎作用，可减少抑郁样行为，而人类研究则表明，当实验诱发压力和焦虑时，食用可可能有效改善负面情绪。目前，这类研究的结论仍然存在争议，而与黑巧克力可能改善情绪作用的相关分子和生理机制也没有被清楚地阐明，因此，需要设计合理的临床研究，以更好地了解黑巧克力摄入对生理和心理状态的影响。众多研究表明，肠道微生物可通过肠-脑轴调节宿主的情绪，因此，操纵肠-脑轴被认为是一种预防或治疗情绪障碍的新技术。
在本研究中，我们旨在检验我们的假设：即黑巧克力对肠道细菌有有益的影响，并可能有助于改善情绪状态，我们开展了一项随机临床试验，通过使用可可含量不同的黑巧克力 (可可含量分别为85%和70%) 来确定健康成年人（20-30岁）食用黑巧克力后肠道微生物的多样性和组成的变化，以及这些变化与参与者的情绪状态之间的联系。本研究中实验队列分为3组，分别是连续3周每天摄入30g 85%可可巧克力（DC85, n = 18）、70%可可巧克力（DC70, n = 16）和健康对照组（CON, n = 14），其中，参试者的情绪状态采用积极和消极情绪量表（PANAS）进行评估，结果表明，每天食用黑巧克力可显著降低DC85的负面情绪，但对DC70没有影响。为了评估黑巧克力改变情绪的作用与肠道微生物群之间的关系，我们对DC85和CON组进行了粪便16S rRNA测序分析。结果表明，DC85组肠道微生物多样性显著高于CON组 (p < 0.05)，与CON组相比，DC85组的卵形布特劳氏菌（Blautia obeum）水平显著升高，而普氏粪植杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）的水平明显降低（p < 0.05）。此外，我们还发现，负面情绪评分的变化与卵形布特劳氏菌的多样性和相对丰度呈负相关（p < 0.05）。本研究结果表明，由于黑巧克力能够重塑肠道微生物的多样性和丰度，因此，黑巧克力具有益生元效应，并可能通过肠道-大脑轴改善消极情绪状态。
论文ID
原名：Consumption of 85% cocoa dark chocolate improves mood in association with gut microbial changes in healthy adults: a randomized controlled trial
译名：85% 可可黑巧克力摄入可改善健康成人与肠道微生物变化相关的情绪状态：一项随机对照试验
期刊：The Journal of Nutritional Biochemistry
IF：6.048
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发表时间：2021.9.14
通讯作者：Woo Young Chun，Dong-Mi Shin
通讯作者单位：韩国忠南大学，韩国首尔大学
DOI号：10.1053/j.gastro.2021.08.041
实验设计
结果
1 受试者的一般特征（基线水平）
本研究共纳入48名合格受试者，并随机分为3组（图1）：对照组（CON，n=14），摄入85%黑巧克力组（DC85，n=18）,摄入70%黑巧克力组（DC70，n=16）。所有受试者的一般特征如表1所示。三组之间的性别比例（p=0.903）、年龄（p=0.603）、体重（p=0.603）、BMI（p=0.601）、骨骼肌含量（p=0.592）、身体脂含量（p=0.447）和体脂百分比（p=0.927）均无统计学差异，三组受试者在总能量 (卡路里)、碳水化合物、脂肪或蛋白质摄入方面也均无显著差异。此外，所有参与者都完成了3周的干预，两组巧克力干预组的平均依从率差异无统计学意义 (DC85组为97.0%，DC70组为96.6%，p = 0.838，数据未显示)。因此，为了检验干预效果，我们最终的统计分析中使用了所有参与者的数据，但有一个DC85样本由于样本采集失败而从肠道微生物分析中删除。
图1 实验流程图CONSORT（试验报告统一标准）随机对照试验各阶段流程图。CON，对照组；DC85，85%可可巧克力组；DC70，70%可可巧克力组表1 受试者在基线水平的一般特征
数据用mean±SD表示，CON，对照组；DC85，85%可可巧克力组；DC70，70%可可巧克力组，P值采用卡方检验、Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析。2 参与者的人体测量参数和饮食摄入量
为了验证试验期间人体测量参数和常规膳食摄入量是否保持一致性，我们在干预结束后对受试者进行了身体成分分析和基于3D的膳食摄入量分析。结果表明，经过3周干预后，各组体重、骨骼肌含量、体脂含量、BMI和体脂百分比均无统计学差异（附表2）。另外，三组在能量和大量营养素摄入方面没有显著差异，虽然DC70组的能量摄入量略低，但与其他组无显著差异 (p=0.421)（附表2）。
3 黑巧克力摄入对情绪状况的影响
为了检验食用黑巧克力是否会影响日常生活中的情绪状态，我们在三周干预期前后均测量了对情绪积极和消极的影响。结果发现，黑巧克力的摄入对积极情绪没有显著影响（p=0.498，表2），但可显著改变消极情绪（表2）。DC85组的消极情绪显著得以改善（-4.33±5.91, p = 0.029），而DC70组的消极情绪经过干预后的变化与CON组相比无显著差异（表2）。这些结果表明，摄入可可含量较高的黑巧克力对消极的情绪状态有积极的影响。
表2 积极和消极影响评分表
数据用mean±SD表示，CON，对照组；DC85，85%可可巧克力组；DC70，70%可可巧克力组，P值采用Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析与Dunnett’s多重比较检验。不同的上标符号表示同一列的不同组之间存在显著差异。4 食用黑巧克力对肠道微生物多样性的影响
为了评估黑巧克力摄入对与情绪变化相关的肠道微生物谱的影响，我们对干预前后收集的粪便样本进行了细菌基因组DNA的16S rRNA测序分析。在DC85组中观察到每日黑巧克力的摄入对消极情绪有显著改善，这促使我们去检查肠道微生物群的任何变化，因为这些变化都可能是由摄入85%的黑巧克力引起的。首先，我们通过Faith’s系统发育多样性指数（Faith’s PD）、OTUs数量和Shannon’s H指数这几个指标比较了组间α-多样性，检测并比较了干预基线点和干预结束时DC85组和CON组肠道微生物群落α-多样性的差异（图2A-C），结果发现，与CON组相比，DC85组的Faith’s PD和检测到的OTUs数量均显著增加（分别是p = 0.017和p = 0.003），但Shannon’s H指数在D85组仅有轻微升高，与CON组没有统计学差异（p = 0.377，图2C）。这些结果表明，每天摄入85%的黑巧克力会增加肠道微生物群落的多样性。
5 食用黑巧克力对肠道微生物组成的影响
接下来，为了进一步探究摄入黑巧克力可显著影响的微生物群，我们比较了CON组和DC85组在不同分类水平上的肠道微生物组成。 在门水平上，组间没有显著差异(数据未显示)。然而，与CON组相比，人类肠道微生物中最丰富的两个门——厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）的比例 (F/B) 在DC85组中有略有降低，但差异不显著（ p = 0.421，图2D）。在种的水平上，与CON组相比, 卵形布特劳氏菌（ Blautia obeum）和普氏粪植杆菌（ Faecalibacterium prausnitzii）的相对丰度在DC85组有显著变化（ p = 0.042，图2E-F），这些结果都确定了食用黑巧克力对肠道微生物组成的影响。
图2 食用黑巧克力后肠道微生物多样性和组成的变化α-多样性指数变化：（A）Faith’s PD，（B）OTUs数量，（C）CON组和DC85组的Shannon’s H指数变化。（D）与CON组相比，DC85组中厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)以及有显著变化的肠道微生物种类的相对丰度。小提琴图显示了数据的频率分布状况，线在中位数和四分位数位置。P值计算采用多次t检验，通过多次检验Benjamini-Hochberg的方法来控制错误发现率(FDR)。PD, 系统发育多样性；OTU, 操作分类单元。6 肠道微生物与宿主情绪状态之间的关系
为了研究肠道微生物群与宿主情绪之间的联系，我们进行了细菌多样性与显著改变的分类群和PANAS评分之间的Spearman’s相关性分析（图3A）。结果表明，积极情感评分与F/B比率呈正相关（r=0.425, p = 0.017；图3A），但DC85组的积极情感评分没有显著变化。我们假设这是由CON中的反应偏差 (社会期望偏差) 所致，而这种偏差会导致积极情感得分小幅增加，最终导致其与F/B比率呈正相关，另外，消极情感评分与OTUs检出数呈负相关（r=-0.402, p = 0.025；图3B）。此外，在因食用黑巧克力而显著改变的细菌类群中，卵形布特劳氏菌的相对丰度与消极情感评分呈负相关（r=-0.383, p = 0.034；图3C），然而普氏粪植杆菌的水平变化与情绪状态之间没有相关性。这些结果表明，摄入85%黑巧克力所产生的情绪改变效应可能是由肠道微生物的多样性和丰度的变化介导的。
图3 肠道微生物多样性和类群变化与情绪状态的关系（A）用热图代表Spearman相关性分析的结果，与CON组相比，DC85组的肠道微生物指标和情绪得分之间的相关性。P值由Spearman’s相关性分析得出（B）细菌多样性指数 (观察到的OTUs数目) 与消极情感评分的相关性分析（C）黑巧克力摄入后，卵形布特劳氏菌 (Blautia obeum) 的相对丰度与消极情感评分的相关性分析。斯皮尔曼相关系数 (r) 和显著性水平 (p) 在每个图中均有表示。图表中的每个点代表了来自个体受试者的检测数据 (时间点之间: 干预后-干预前) 。橙色和绿色的圆圈分别代表CON组和DC85组。
讨论
一直以来，黑巧克力都被心理学家认为具有改变情绪的特性，包括增加愉悦和享受的感觉，然而，之前关于巧克力对情绪具有积极影响的证据均是在实验诱导的应激条件下产生的，且不同的实验结果有时还不一致，因此，关于日常生活中摄入黑巧克力对情绪的影响证据是有限的，此外，很少有研究探索摄入黑巧克力改变情绪作用的相关分子和生理机制。最近的研究表明，肠道微生物具有广泛的生物学调节效应，包括通过肠-脑轴对大脑功能和行为产生影响，已有一些人类研究表明，肠道微生物发生改变的人，会表现出某些精神变化，这些变化均与肠-脑轴的调节有关。因此，本随机对照试验特别参照肠-脑轴，研究黑巧克力的摄入是否影响健康成人的情绪，以及情绪的变化是否与肠道微生物的调节相关。
在本研究中，每天摄入黑巧克力显著减轻了85%可可巧克力组 (DC85) 的消极情绪，但没有减轻70%可可巧克力组(DC70)的消极情绪。之前有研究表明，可可对大脑功能的影响可能会因可可摄入的含量而不同。一项随机、安慰剂对照试验表明，高剂量可可多酚治疗 (500 mg多酚) 可显著改善积极情绪，而低剂量治疗 (250mg多酚) 则对情绪没有影响。本研究与之前的发现一致，DC85组 (参与者每天摄入大约400mg多酚) 与DC70组 (每天摄入250mg多酚) 相比，表现出了显著的情绪影响，因此，我们进一步仅研究了食用黑巧克力对DC85组肠道微生物的影响。
越来越多的证据表明，肠道微生物多样性指标（包括丰富度和均匀度）可作为疾病状态的标志，但很少有研究表明，细菌多样性的减少会改变疾病的易感状态，包括炎症性肠病、重度抑郁症和焦虑症，一个物种丰富的微生物群能够稳定地抵御外来病原体的入侵，从而形成一个稳定的肠道环境。肠道微生物的多样性和组成也与情绪健康有关。例如，肠道微生物多样性的增加与较多的积极情绪和较少的孤独感相关，与之前的研究一致，我们的研究结果表明，摄入黑巧克力增加的微生物多样性对健康成年人的情绪状态有积极的影响。
单个细菌群也可以作为宿主情绪状态的标记物，在本研究中，我们观察到DC85组普氏粪植杆菌的丰度较低，类似地，另一项研究也报告了粪杆菌属（Faecalibacterium）的丰度与情绪之间存在负相关，此外，我们的结果还表明，DC85组有更丰富的布劳特氏菌（Blautia），其与情绪评分的积极变化显著相关。以往有报道称，与抑郁症、自闭症和精神分裂症等精神疾病患者相比，健康对照组的微生物群中布劳特氏菌含量更为丰富，此外，在应激动物实验中，药物抑制炎性小体信号的产生会增加Blautia spp. 的表达水平，这些研究结果表明，布劳特氏菌或可作为精神疾病肠道菌群-脑轴的微生物干预靶点。卵形布特劳氏菌可产丁酸，这是一种公认的脑功能调节剂，有报道称丁酸盐在小鼠模型中具有抗抑郁样作用，并逆转大鼠的抑郁行为，因此，我们认为，微生物源丁酸盐的变化可能有助于DC85组情绪评分的积极变化。
现有证据表明，可可的精神改善作用可能源于黑巧克力中的多种多酚化合物，一项大型流行病学研究表明，饮食中多酚的高摄入量与抑郁症状呈负相关。此外，另一项系统综述总结称，饮食中的多酚和异黄酮摄入与抑郁症状也呈负相关，而这类效应的作用机制可能包括多酚具有抗氧化和降低皮质醇的功能。例如，可可中主要的类黄酮化合物儿茶素和表儿茶素可以通过抗氧化作用穿过血脑屏障，发挥神经保护作用，此外，摄入富含多酚的巧克力可显著降低成年人的唾液皮质醇水平，而唾液皮质醇可以调节下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴。由于HPA轴在焦虑和抑郁等与应激相关的症状中发挥作用，因此，巧克力摄入引起的皮质醇减少可能有助于可可的情绪调节作用。大多数膳食多酚以酯类或聚合物的形式存在，它们必须通过肠道酶或肠道微生物的转化，而成为具有生物活性的酚类化合物，因此，肠道细菌在上述多酚的神经保护作用中起着主要调控作用。此外，肠道细菌的多酚代谢还可通过改变肠道微生物群落及其功能，进而对宿主的健康产生有利影响，例如，如本研究所示，摄入膳食多酚会增加拟杆菌门杆菌的水平，从而降低了F/B比率。总体来说，考虑到肠道微生物在多酚生物利用度、代谢和大脑功能方面的作用，我们的研究结果表明，每天摄入富含多酚的巧克力会逐渐改变肠道微生物的多样性，并-对宿主的情绪产生有益的影响。
据报道，使用益生元 (作为肠道细菌的食物) 或针对肠-脑轴的益生菌可显著改善或消除某些精神疾病的症状，由此可见，维持肠道微生物的良好共生状况对大脑的健康至关重要。在本研究中，随着情绪状态的改变，我们证明了在DC85组中厚壁菌门与拟杆菌门的比例略有降低，但并不显著。厚壁菌门和拟杆菌门是肠道微生物群中的两大门类，它们在人体肠道的组成和功能稳定方面发挥重要作用，因此，F/B比率作为与肥胖和其他疾病相关的微生物标志物已被广泛研究。有研究表明，重度抑郁症 (MDD) 患者的厚壁菌门丰度显著高于健康对照组，同时，MDD患者的F/B比率显著升高，这些结果支持了我们的发现，即在DC85组中，F/B比率的降低可能与肠道微生物群组成的积极变化和消极情绪状态的改善有关。
本研究存在一定的局限性。例如，我们在对照组的研究对象处理中，没有遵守盲法原则，但研究人员对治疗组的分配是遵循了盲法原则的，以此尽量减少结果的偏倚，所以本研究的结果仍可认为具有客观性，缺乏适当的安慰剂对照是本次研究的另一个局限性，应在未来的研究中加以考虑。此外，尽管本研究中使用的PANAS量表已被广泛应用，其信度和效度也得到了很好的证明，但由于本研究中的情绪状态是被试者自我评估的，因此结果可能存在反应偏倚。最后，肠道微生物影响情绪状态的潜在机制尚不清楚，在未来的研究中，可在黑巧克力摄入后探索肠-脑的生物学信号改变状况。
尽管本研究有一定局限性，但据我们所知，这是第一个证明日常生活中的黑巧克力摄入会影响生理和心理状态的研究，这些结果表明，黑巧克力可通过重组肠道微生物群的多样性和组成而发挥益生元的效应，从而可能通过肠-脑轴改善情绪。
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